Holandski istraživači kombinuju CRISPR i bioluminiscenciju u eksperimentalnom testu zazarazne bolesti

Novorazvijeni noćni protein mogao bi ubrzati i pojednostaviti dijagnozu virusnih bolesti, tvrde istraživači u Holandiji.
Njihova studija, objavljena u srijedu u ACS Publications, opisuje osjetljivu metodu u jednom koraku za brzu analizu virusnih nukleinskih kiselina i njihovog izgleda korištenjem svijetlećih svijetloplavih ili zelenih proteina.
Identifikacija patogena otkrivanjem njihovih otisaka nukleinskih kiselina ključna je strategija u kliničkoj dijagnostici, biomedicinskim istraživanjima i praćenju sigurnosti hrane i okoliša.Široko korišteni kvantitativni testovi lančane reakcije polimerazom (PCR) su vrlo osjetljivi, ali zahtijevaju sofisticiranu pripremu uzoraka ili interpretaciju rezultata, što ih čini nepraktičnim za neke zdravstvene ustanove ili okruženja s ograničenim resursima.
Ova grupa iz Holandije rezultat je saradnje naučnika sa univerziteta i bolnica kako bi razvili brzu, prenosivu i jednostavnu dijagnostičku metodu nukleinskih kiselina koja se može primeniti u različitim okruženjima.
Inspirisani su bljeskovima krijesnica, sjajima krijesnica i sićušnim zvijezdama vodenog fitoplanktona, a sve to pokreće fenomen koji se zove bioluminiscencija.Ovaj efekat sjaja u mraku uzrokovan je hemijskom reakcijom koja uključuje protein luciferaze.Naučnici su ugradili proteine ​​luciferaze u senzore koji emituju svetlost kako bi olakšali posmatranje kada pronađu metu.Iako ovo čini ove senzore idealnim za otkrivanje na licu mjesta, trenutno im nedostaje visoka osjetljivost potrebna za kliničke dijagnostičke testove.Iako CRISPR metoda za uređivanje gena može pružiti ovu mogućnost, zahtijeva mnogo koraka i dodatnu specijaliziranu opremu za otkrivanje slabog signala koji može biti prisutan u složenim, bučnim uzorcima.
Istraživači su pronašli način da kombinuju protein vezan za CRISPR sa bioluminiscentnim signalom koji se može detektovati jednostavnom digitalnom kamerom.Kako bi se uvjerili da ima dovoljno uzorka RNK ili DNK za analizu, istraživači su izveli amplifikaciju polimeraze rekombinaze (RPA), jednostavnu tehniku ​​koja radi na konstantnoj temperaturi od oko 100°F.Razvili su novu platformu nazvanu Luminescent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), u kojoj su dva proteina CRISPR/Cas9 specifična za različite susjedne dijelove virusnog genoma, svaki sa jedinstvenim fragmentom luciferaze koji je vezan za njih iznad.
Kada je prisutan specifični virusni genom koji istraživači ispituju, dva CRISPR/Cas9 proteina se vezuju za ciljnu sekvencu nukleinske kiseline;postaju u neposrednoj blizini, dozvoljavajući netaknutom proteinu luciferaze da se formira i emituje plavo svetlo u prisustvu hemijskog supstrata..Kako bi uračunali supstrat koji je utrošen u ovom procesu, istraživači su koristili kontrolnu reakciju koja je emitirala zeleno svjetlo.Cjevčica koja mijenja boju iz zelene u plavu ukazuje na pozitivan rezultat.
Istraživači su testirali svoju platformu razvijajući RPA-LUNAS test, koji detektujeSARS-CoV-2 RNKbez zamorne izolacije RNK, i pokazao je svoje dijagnostičke performanse na uzorcima nazofaringealnog brisa izCOVID 19pacijenata.RPA-LUNAS je uspješno otkrio SARS-CoV-2 u roku od 20 minuta u uzorcima s RNK virusnim opterećenjem od čak 200 kopija/μL.
Istraživači vjeruju da njihov test može lako i efikasno otkriti mnoge druge viruse.“RPA-LUNAS je atraktivan za testiranje na zarazne bolesti u liječenju,” napisali su.